La droga aprobada por la FDA, ivermectina, inhibe la reproducción del SARS-CoV-2 in vitro
RESUMEN
Aunque actualmente se están llevando a cabo varios ensayos clínicos para probar posibles terapias, la respuesta mundial al brote de COVID-19 se ha limitado en gran medida a la vigilancia/contención. Informamos aquí que la ivermectina, un antiparasitario aprobado por la FDA que anteriormente demostró tener una actividad antiviral de amplio espectro in vitro, es un inhibidor del virus causante (SARS-CoV-2), con una sola adición a las células Vero-hSLAM 2 h después de la infección con SARS-CoV-2 capaz de efectuar una reducción de ~5000 veces el ARN inviral a las 48 h. Por lo tanto, la ivermectina justifica una mayor investigación para posibles beneficios en los seres humanos.
1 Introducción
La ivermectina es un agente antiparasitario de amplio espectro aprobado por la FDA (González Canga et al., 2008) que en los últimos años, junto con otros grupos, ha demostrado tener actividad antiviral contra una amplia gama de virus (Gotz et al., 2016; Lundberg et al., 2013; Tay et al., 2013; Wagstaffet al., 2012) in vitro. Identificado originalmente como un inhibidor de la interacción entre la proteína IN (IN) del virus de inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) y el heterodímero importado (IMP)α/β1, responsable de la importación nuclear de IN (Wagstaffet al., 2011), se ha confirmado que la ivermectina inhibe la importación nuclear de IN y la replicación del VIH-1 (Wagstaffet al., 2012).
Se han notificado otras acciones de la ivermectina (Mastrangelo et al., 2012), pero se ha demostrado que la ivermectina inhibe la importación nuclear del huésped (p. ej., (Kosyna et al., 2015;van der Watt et al.,2016)) y de las proteínas virales, entre ellas la proteína no estructural 5 del virus símico SV40 (T-ag) y el virus del dengue (DENV) (Wagstaffet al., 2012,Wagstaffet al., 2011).
Es importante señalar que se ha demostrado que limita la infección por virus de ARN como el DENV 1-4 (Tayet al., 2013), el virus del Nilo Occidental (Yang et al., 2020), el virus de la equinencefalitis venezolana (VEEV) (Lundberg et al.., 2013) y la gripe (Gotzet al., 2016), y se cree que esta actividad de amplio espectro se debe a la acción de muchos virus de ARN diferentes en IMPα/β1 durante la infección (Caly et al., 2012; Jans et al., 2019).
La ivermectina también ha demostrado ser eficaz contra el virus de la pseudorabia del ADN (PRV), tanto in vitro como in vivo, y el tratamiento con ivermectina ha demostrado aumentar la supervivencia en ratones infectados con PRV (Lv et al., 2018).
Se observó la eficacia de la ivermectina contra el virus Zika (ZIKV) en ratones, pero los autores reconocieron que las limitaciones del estudio justificaban la reevaluación de la actividad de la ivermectina contra el ZIKV (Ketkar y otros, 2019). Por último, la ivermectina fue el tema central de un ensayo clínico de fase III en Tailandia en 2014-2017, contra la infección por el virus DENV, en el que se observó que una sola dosis diaria por vía oral era segura y daba lugar a una reducción significativa de los niveles séricos de la proteína viralNS1, pero no se observó ningún cambio en la viremia ni ningún beneficio clínico (véase más adelante) (Yamasmith et al, El agente causante de la actual pandemia de COVID-19, el SARS-CoV-2, es un virus de ARN de sentido positivo de una sola hebra que está estrechamente relacionado con el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV).
Los estudios sobre las proteínas del SARS-CoV han revelado un posible papel de IMPα/β1 durante la infección en el cierre nucleocítoplásico dependiente de la señal de la proteína de la nucleocápside del SARS-CoV (Rowland et al., 2005; Timani et al., 2005;Wulan et al., 2015), que puede repercutir en la división de la célula huésped (Hiscox et al., 2001; Wurm et al., 2001). Además, se ha demostrado que la proteína accesoria del SARS-CoV, la proteínaORF6, antagoniza la actividad antiviral del factor de transcripción STAT1 al secuestrar IMPα/β1 en la ER/Golgimembrana rugosa (Frieman et al., 2007). En conjunto, estos informes sugieren que la actividad inhibidora del transporte nuclear de la ivermectina puede ser eficaz contra el SARS-CoV-2.
Para probar la actividad antiviral de la ivermectina contra el SARS-CoV-2, se infectaron células Vero/hSLAM con SARS-CoV-2 aisladas Australia/VIC01/2020 con un MOI de 0,1 durante 2 h, seguido de la adición de 5μM iver-mectin. El sobrenadante y los gránulos de células se recogieron en los días 0-3 y se analizaron mediante RT-PCR para la replicación del ARN del SARS-CoV-2 (Fig. 1A/B).https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2020 .104787Recibido el 18 de marzo de 2020; Recibido en forma revisada el 27 de marzo de 2020; Aceptado el 29 de marzo de 2020.
Fig. 1. La ivermectina es un potente inhibidor del aislado clínico del SARS-CoV-2 Australia/VIC01/2020. Las células Vero/hSLAM estaban en el aislado clínico del SARS-CoV-2 Australia/VIC01/2020 (MOI = 0,1) durante 2 h antes de la adición del vehículo (DMSO) o la Ivermectina a las concentraciones indicadas. Se tomaron muestras a los 0-3 días de la infección para la cuantificación de la carga viral utilizando la PCR en tiempo real del virus asociado a la célula (A) o del sobrenadante (B). Los valores de IC50 se determinaron en experimentos posteriores a las 48 h posteriores a la infección utilizando las concentraciones indicadas de Ivermectina (tratada a las 2 h posteriores a la infección según A/B). Se realizaron análisis triplicados de PCR en tiempo real en virus asociados a células (C/E) o sobrenadantes (D/F) utilizando sondas contra los genes del SARS-CoV-2 E (C/D) o RdRp (E/F). Los resultados representan la media ± SD (n = 3). Se ajustaron 3 curvas de respuesta a la dosis de tres parámetros utilizando el prisma GraphPad para determinar los valores IC50 (indicados). G. Esquema de la acción antiviral propuesta por la ivermectina sobre el coronavirus. IMPα/β1 se une a la proteína de carga del coronavirus en el citoplasma (arriba) y la traslada a través del complejo de poros nucleares (NPC) al núcleo donde el complejo se desmorona y la carga viral puede reducir la respuesta antiviral de la célula anfitriona, lo que conduce a una mayor infección. La ivermectina se une y desestabiliza el heterodímero de Impα/β1, impidiendo así que éste se una a la proteína vírica (fondo) e impidiendo que entre en el núcleo. Esto probablemente resulta en …una reducción de la inhibición de las respuestas antivirales, lo que lleva a una respuesta antiviral normal y más eficiente.
Los autores desean que los lectores conozcan la siguiente carta publicada por la FDA titulada: “No utilice la ivermectina destinada a los animales como tratamiento para la COVID-19 en los seres humanos “en https://www.fda.gov/animal-veterinary/product-safety-information/fda-letter-stakeholders-do-not-use-ivermectin-intended-animals-treatment-covid-19-humans.
∗Corresponding author.E-mail address:kylie.wagstaff@monash.edu(K.M. Wagstaff).Antiviral Research 178 (2020) 104787
Disponible en línea el 3 de abril de 20200166-3542/ © 2020 The Author(s). Publicado por Elsevier B.V. Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/BY-NC-ND/4.0/).T
A las 24 h, hubo una reducción del 93% del ARN viral presente en el sobrenadante (indicativo de viriones liberados) de las muestras tratadas con ivermectina en comparación con el vehículo DMSO. Análogamente, se observó una reducción del 99,8% en el ARN viral asociado a las células (indicativo de viriones no liberados y no empaquetados) con el tratamiento con ivermectina. A las 48 h este efecto aumentó a una reducción de ~5000 veces el ARN viral en el tratamiento con ivermectina comparado con las muestras de control, lo que indica que el tratamiento con ivermectina resultó en la pérdida efectiva de esencialmente todo el material viral por 48 h. De acuerdo con esta idea, no se produjo ninguna otra reducción del ARN viral observado a las 72 h. Como hemos observado anteriormente (Lundberg et al., 2013; Tay y otros, 2013; Wagstaff y otros, 2012), no hay toxicidad de la ivermectina se observó en cualquiera de los puntos temporales analizados, en cualquiera de los pozos de muestra o en paralelo muestras de drogas probadas solamente.
Para determinar con más detalle la eficacia de la ivemectina, las células infectadas con SARS-CoV-2 fueron tratados con diluciones seriadas de ivermectina 2 h después de la infección y el sobrenadante y los gránulos de células recogidos en tiempo real RT-PCR a 48 h (Fig. 1C/D). Como en el caso anterior, una reducción >5000 en el ARN viral se observó tanto en el sobrenadante como en los gránulos de células de las muestras tratadas con 5 μM ivermectina a 48 h, lo que equivale a una reducción del 99,98% en la ARN en estas muestras. Una vez más, no se observó ninguna toxicidad con la ivermectina en cualquiera de las concentraciones probadas. El IC50 del tratamiento con ivermectina se determinó que era ~2 μM en estas condiciones. Subrayando el El hecho de que el ensayo haya detectado específicamente el SARS-CoV-2, RT-PCR los experimentos se repitieron usando primers específicos para el RdRp viral (Fig. 1E/F) en lugar del gen E (arriba), con casi idéntico resultados observados tanto para los liberados (sobrenadantes) como para los asociados a las células virus.
En conjunto, estos resultados demuestran que la ivermectina tiene acción antiviral contra el aislado clínico del SARS-CoV-2 in vitro, con una dosis única capaz de controlar la replicación viral en un plazo de 24-48 h en nuestro sistema. Nuestra hipótesis es que esto es probable mediante la inhibición de la importación nuclear de proteínas virales mediada por IMPα/β1 (Fig. 1G), como se muestra para otros virus de ARN (Tay et al., 2013; Wagstaff et al., 2012; Yang et al., 2020); la confirmación de este mecanismo en el caso del SARS-CoV-2, y la identificación del SARS-CoV-2 específico y/o componente(s) huésped(es) impactado(s) (véase (Yang et al., 2020)) es un importante foco de trabajo futuro en este laboratorio. En última instancia, el desarrollo de un antiviral eficaz para el SARSCoV-2, si se administra a los pacientes en las primeras etapas de la infección, podría ayudar a limitar la carga viral, prevenir la progresión grave de la enfermedad y limitar la transmisión entre personas. Pruebas de referencia de la ivermectina frente a otros potenciales antivirales para el SARS-CoV-2 con mecanismos de acción alternativos (Dong y otros, 2020; Elfiky, 2020; Gordon y otros, 2020; Li y De Clercq, 2020; Wang et al., 2020) sería por lo tanto importante tan pronto como fuera posible.
Este breve informe plantea la posibilidad de que la ivermectina pueda ser una antiviral útil para limitar el SARS-CoV-2, de manera similar a los ya existentes (Dong y otros, 2020; Elfiky, 2020; Gordon y otros, 2020; Li y De Clercq, 2020; Wang et al., 2020); hasta que se demuestre que uno de ellos es beneficioso en un entorno clínico, todo debe ser perseguido tan rápidamente como posible.
La ivermectina tiene un perfil de seguridad establecido para el uso humano (González Canga y otros, 2008; Jans y otros, 2019; Buonfrate y otros, 2019), y está aprobada por la FDA para varias infecciones parasitarias (González Canga y otros, 2008; Buonfrate y otros, 2019). Es importante señalar que los exámenes y meta-análisis recientes indican que la Ivermectina en dosis altas tiene una seguridad comparable a la del tratamiento estándar en dosis bajas, aunque no hay pruebas suficientes para sacar conclusiones sobre el perfil de seguridad en el embarazo (Navarro y otros, 2020; Nicolas y otros, 2020). El siguiente paso crítico en la evaluación de los posibles beneficios en los pacientes de COVID-19 será examinar un régimen de dosis de adición múltiple que imite el uso actual aprobado de la ivermectina en los humanos. Como se ha señalado, la ivermectina fue objeto de un reciente ensayo clínico de fase III en pacientes con dengue en Tailandia, en el que se determinó que una sola dosis diaria era segura pero no producía ningún beneficio clínico. Sin embargo, los investigadores observaron que podría desarrollarse un régimen de dosificación mejorado, basado en datos farmacocinéticos (Yamasmith et al., 2018). Aunque el DENV es claramente muy diferente al SARS-CoV-2, este diseño de ensayo debería informar el trabajo futuro que se está llevando a cabo.
En total, el informe actual, combinado con un perfil de seguridad conocido, demuestra que la ivermectina es digna de mayor consideración como posible antiviral del SARS-CoV-2.
2. Métodos
2.1. El cultivo de células, la infección viral y el tratamiento con drogas Las células Vero/hSLAM (Ono et al., 2001) se mantuvieron en el medio mínimo esencial de Earle (EMEM) que contiene 7% de suero bovino fetal (FBS) (Bovogen Biologicals, Keilor East, AUS) 2 mM de L-Glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 1500 mg/L de bicarbonato de sodio, 15 mM de HEPES y 0,4 mg/ml de genealina a 37 °C, 5% de CO2. Las células se sembraron en placas de cultivo de tejido de 12 pozos 24 h antes de la infección con SARS-CoV-2 (aislado de Australia/VIC01/2020) con un MOI de 0,1 en el medio de infección (según el medio de mantenimiento pero que contiene sólo 2% de FBS) durante 2 h. El medio que contenía el inóculo se retiró y se reemplazó con 1 mL de medio fresco (2% de FBS) que contenía Ivermectina a las concentraciones indicadas o DMSO solo y se incubó según lo indicado durante 0-3 días. En la apropiada punto de tiempo, el sobrenadante de la célula fue recogido y girado durante 10 minutos a 6.000 g para eliminar los escombros y el sobrenadante transferido a una nueva colección tubos. Las monocapas celulares fueron recogidas por raspado y resuspensión en 1 mL de medios frescos (2% FBS). Se establecieron controles de toxicidad en paralelo en cada experimento con células no infectadas.
2.2. La generación de ARN cDNA del SARS-CoV-2 se extrajo de 200 alícuotas μL de sobrenadante de muestra o suspensión celular utilizando el kit HT del virus QIAamp 96 QIAcube (Qiagen, Hilden, Alemania) y se eluyó en 60 μl. La transcripción inversa se realizó utilizando el kit de ADNc BioLine SensiFAST (Bioline, Londres, Reino Unido), mezcla de reacción total (20 μl), que contiene 10 μL de ARN
extracto, 4 μl de 5x TransAmp buffer, 1 μl de Reverse ranscriptase y 5 μl de agua libre de Nucleasa. Las reacciones se incubaron a 25 °C para 10 min, 42 °C durante 15 min y 85 °C durante 5 min.
2.3. Detección de SARS-CoV-2 mediante un ensayo de RT-PCR en tiempo real TaqMan Los ensayos de RT-PCR TaqMan se realizaron utilizando 2,5 μl cDNA, 10 μl Diseño de cebadores PrecisonPLUS qPCR Master Mix 1 μM Adelante (5′- AAA TTC TAT GGT GGT TGG CAC AAC ATG TT-3′), 1 μM Atrás (5′- TAG GCA TAG CTC TRT CAC AYT T-3′) cebadores y 0. 2 μM sonda (5′-FAMTGG GTT GGG ATT ATC-MGBNFQ-3′) que apunta al gen BetaCoV RdRp (ARN polimerasa dependiente de ARN) o Forward (5′-ACA GGT ACG Fig. 1. La ivermectina es un potente inhibidor del aislado clínico del SARS-CoV-2 Australia/VIC01/2020. Las células Vero/hSLAM estaban en el aislado clínico del SARS-CoV-2 Australia/VIC01/2020 (MOI = 0,1) durante 2 h antes de la adición del vehículo (DMSO) o la Ivermectina a las concentraciones indicadas.
Se tomaron muestras a los 0-3 días de la infección para la cuantificación de la carga viral utilizando la PCR en tiempo real del virus asociado a la célula (A) o del sobrenadante (B). Los valores de IC50 se determinaron en experimentos posteriores a las 48 h posteriores a la infección utilizando las concentraciones indicadas de Ivermectina (tratada a las 2 h posteriores a la infección según A/B). Se realizaron análisis triplicados de PCR en tiempo real en virus asociados a células (C/E) o sobrenadantes (D/F) utilizando sondas contra los genes del SARS-CoV-2 E (C/D) o RdRp (E/F). Los resultados representan la media ± SD (n = 3).
Se ajustaron 3 curvas de respuesta a la dosis de tres parámetros utilizando el prisma GraphPad para determinar los valores IC50 (indicados). G. Esquema de la acción antiviral propuesta por la ivermectina sobre el coronavirus. IMPα/β1 se une a la proteína de carga del coronavirus en el citoplasma (arriba) y la traslada a través del complejo de poros nucleares (NPC) al núcleo donde el complejo se desmorona y la carga viral puede reducir la respuesta antiviral de la célula anfitriona, lo que conduce a una mayor infección. La ivermectina se une y desestabiliza la
Impα/β1 heterodímero, impidiendo así que Impα/β1 se una a la proteína vírica (fondo) e impidiendo que entre en el núcleo. Esto probablemente resulta en una reducción de la inhibición de las respuestas antivirales, lo que lleva a una respuesta antiviral normal y más eficiente.
L. Caly, et al. Antiviral Research 178 (2020) 104787 3
TTA ATA GTT AAT AGC GT -3′), 1 μM Reverse (5′-ATA TTG CAG CAG TAC GCA CAC A-3′) primers y 0,2 μM probe (5′-FAM-ACA CTA GCC ATC CTT ACT GCG CTT CG-286 NFQ-3′) dirigidos al gen E de BetaCoV (Corman et al., 2020). Se realizaron ensayos de RT-PCR en tiempo real en una máquina de PCR en tiempo real Applied Biosystems ABI 7500 Fast (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) utilizando condiciones de ciclo de 95 °C durante 2 min, 95 °C durante 5 s, 60 °C durante 24 s. Se utilizó el ADNc del SARS-CoV-2 (Ct~28) como control positivo.
Los valores calculados de Ct fueron convertidos a reducción de pliegues
de las muestras tratadas en comparación con el control mediante el método ΔCt (pliegue cambiado en el ARN viral=2^ΔCt) y expresado como % de DMSO solo muestra. Los valores de IC50 fueron ajustados usando 3 curvas de respuesta a la dosis. en el prisma GraphPad.
Financiación
Este trabajo fue apoyado por una Beca de la Fundación Nacional de Cáncer de Mama, Australia (ECF-17-007) para KMW y un Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (NHMRC), Australia Senior Prinicple Research Fellow (SPRF) (APP1103050) para DAJ.
References
Buonfrate, D., et al., 2019. Multiple-dose versus single-dose ivermectin for Strongyloides stercoralis infection (Strong Treat 1 to 4): a multicentre, open-label, phase 3, randomised controlled superiority trial. Lancet Infect. Dis. 19 (11), 1181–1190.
Caly, L., Wagstaff, K.M., Jans, D.A., 2012. Nuclear trafficking of proteins from RNA viruses: potential target for anti-virals? Antivir. Res. 95, 202–206.
Corman, V.M., et al., 2020. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by realtime RT-PCR. Euro Surveill. 25 (3).
Dong, L., Hu, S., Gao, J., 2020. Discovering drugs to treat coronavirus disease 2019 (COVID-19). Drug Discov. Ther. 14 (1), 58–60.
Elfiky, A.A., 2020. Anti-HCV, nucleotide inhibitors, repurposing against COVID-19. Life Sci. 248, 117477.
Frieman, M., et al., 2007. Severe acute respiratory syndrome coronavirus ORF6 antagonizes STAT1 function by sequestering nuclear import factors on the rough endoplasmic reticulum/Golgi embrane. J. Virol. 81 (18), 9812–9824.
Gonzalez Canga, A., et al., 2008. The pharmacokinetics and interactions of ivermectin in humans–a mini-review. AAPS J. 10 (1), 42–46. Gordon, C.J., et al., 2020 Apr 10. The antiviral compound remdesivir potently inhibits RNA-dependent RNA polymerase from Middle East respiratory syndrome coronavirus. J. Biol. Chem. 295 (15), 4773–4779.
Gotz, V., et al., 2016. Influenza A viruses escape from MxA restriction at the expense of efficient nuclear vRNP import. Sci. Rep. 6, 23138.
Hiscox, J.A., et al., 2001. The coronavirus infectious bronchitis virus nucleoprotein localizes to the nucleolus. J. Virol. 75 (1), 506–512.
Jans, D.A., Martin, A.J., Wagstaff, K.M., 2019. Inhibitors of nuclear transport. Curr. Opin.
Cell Biol. 58, 50–60. Ketkar, H., et al., 2019. Lack of efficacy of ivermectin for prevention of a lethal Zika virus infection in a murine system. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 95 (1), 38–40.
Kosyna, F.K., et al., 2015. The importin alpha/beta-specific inhibitor Ivermectin affects HIF-dependent hypoxia response pathways. Biol. Chem. 396 (12), 1357–1367.
Li, G., De Clercq, E., 2020. Therapeutic options for the 2019 novel coronavirus (2019-nCoV). Nat. Rev. Drug Discov. 19 (3), 149–150.
Lundberg, L., et al., 2013. Nuclear import and export inhibitors alter capsid protein distribution in mammalian cells and reduce Venezuelan Equine Encephalitis Virus replication. Antivir. Res. 100 (3), 662–672.
Lv, C., et al., 2018. Ivermectin inhibits DNA polymerase UL42 of pseudorabies virus entrance into the nucleus and proliferation of the virus in vitro and vivo. Antivir. Res. 159, 55–62.
Mastrangelo, E., et al., 2012 Aug. Ivermectin is a potent inhibitor of flavivirus replication specifically targeting NS3 helicase activity: new prospects for an old drug. J. Antimicrob. Chemother. 67 (8), 1884–1894.
Navarro, M., et al., 2020. Safety of high-dose ivermectin: a systematic review and metaanalysis.
J. Antimicrob. Chemother. 75 (4), 827–834.
Nicolas, P., et al., 2020. Safety of oral ivermectin during pregnancy: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health 8 (1), e92–e100.
Ono, N., et al., 2001. Measles viruses on throat swabs from measles patients use signaling lymphocytic activation molecule (CDw150) but not CD46 as a cellular receptor. J.Virol. 75 (9), 4399–4401.
Rowland, R.R., et al., 2005. Intracellular localization of the severe acute respiratory syndrome coronavirus nucleocapsid protein: absence of nucleolar accumulation during infection and after expression as a recombinant protein in vero cells. J. Virol. 79 (17), 11507–11512.
Tay, M.Y., et al., 2013. Nuclear localization of dengue virus (DENV) 1-4 non-structural protein 5; protection against all 4 DENV serotypes by the inhibitor Ivermectin. Antivir. Res. 99 (3), 301–306.
Timani, K.A., et al., 2005. Nuclear/nucleolar localization properties of C-terminal nucleocapsid protein of SARS coronavirus. Virus Res. 114 (1–2), 23–34.
van der Watt, P.J., et al., 2016. Targeting the nuclear import receptor Kpnbeta1 as an anticancer therapeutic. Mol. Canc. Therapeut. 15 (4), 560–573.
Wagstaff, K.M., et al., 2011. An AlphaScreen(R)-based assay for high-throughput screening for specific inhibitors of nuclear import. J. Biomol. Screen 16 (2), 192–200.
Wagstaff, K.M., et al., 2012. Ivermectin is a specific inhibitor of importin alpha/betamediated nuclear import able to inhibit replication of HIV-1 and dengue virus. Biochem. J. 443 (3), 851–856.
Wang, M., et al., 2020. Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus (2019-nCoV) in vitro. Cell Res. 30 (3), 269–271.
Wulan, W.N., et al., 2015. Nucleocytoplasmic transport of nucleocapsid proteins of enveloped RNA viruses. Front. Microbiol. 6, 553.
Wurm, T., et al., 2001. Localization to the nucleolus is a common feature of coronavirus nucleoproteins, and the protein may disrupt host cell division. J. Virol. 75 (19),9345–9356.
Yamasmith, E., et al., 2018. Efficacy and safety of ivermectin against dengue infection: a phase III, randomized, double-blind, placebo-controlled trial. In: He 34th Annual meeting the Royal College of Physicians of Thailand. Internal Medicine and One Health, Chonburi, Thailand.
Yang, S.N.Y., et al., 2020. The broad spectrum antiviral ivermectin targets the host nuclear transport importin alpha/beta1 heterodimer. Antivir. Res. 104760. L. Caly, et al. Antiviral Research 178 (2020) 1047874
Fuente: https://www.sciencedirect.com/